Генетическое картирование - это картирование, основанное на методах классической генетики - определении групп сцепления, частоты рекомбинации и построении генетических карт, где единицей измерения служат проценты рекомбинации, или сантиморганы (сМ). Цитогенетическое картирование осуществляется с применением методов цитогенетики, когда для локализации каких-либо нуклеотидных последовательностей и определения их взаимного расположения используются цитологические препараты. И, наконец, физическое картирование - это обширная группа методов, позволяющая строить карты генома (обычно их называют физическими) высокого уровня разрешения и определять расстояния между локализуемыми нуклеотидными последовательностями с точностью от нескольких десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.
1)Введение
2) Стратегические подходы к картированию геномов
3) Методы картирования геномов млекопитающих
1.1. Генетическое картирование.
1.3. Физическое картирование.
4)Генетическое картирование генома крупного рогатого скота
5) Словарь
6) Список литературы
Работа содержит 1 файл
Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации о генетических картах хромосом человека, о локализации и функциях отдельных генов и о структуре генома в целом вносят исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством профессора Виктора Мак-Кьюсика. Результатом этих исследований является систематическое, с двухгодичным интервалом между последними шестью публикациями, издание энциклопедий под названием: "Менделевское наследование у человека: каталог генов человека и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in men. Catalog of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes"). Эти издания содержат сводные данные обо всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных болезнях. Появление и развитие компьютерных баз данных, возможность совмещения различных типов карт позволило перейти на качественно новый уровень анализа картированных последовательностей.
1.2. Цитогенетическое картирование.
Одновременно, в эти же годы, были достигнуты большие успехи в области цитогенетики, связанные с возможностью дифференциального окрашивания метафазных хромосом. Методы дифференциального окрашивания позволяют идентифицировать на препарате как отдельную хромосому, так и любой участок хромосомы, выявляя так называемые бэнды. На метафазных хромосомах малой степени спирализации идентифицируются около 750 бэндов, на прометафазных хромосомах 2500 - 3000. На сегодняшний день разработаны методы многоцветной окраски - multicolor banding (до 25 цветов) интерфазных и метафазных хромосом.
Рис.3Цитогенетический анализ клона гибридных клеток, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши со спленоцитами, с помощью FISH с меченной биотином пробой специфической к Х -хромосоме. Видно, что в кариотипе гибридов присутствует только одна Х -хромосома. Результаты анализа с помощью ПЦР маркеров показали, что эта X-хромосома происходит из спленоцитов (линия мышей DD) (b). Эти результаты свидетельствуют о том, что в гибридных клетках произошло замещение собственной Х -хромосомы клеток НМ-1 (мыши 129/Ola) на Х -хромосому спленоцитов взрослой самки DD
Цитогенетические карты показывают локализацию маркера с точностью до определенной хромосомы, плеча или хромосомного сегмента. Этот тип карт показывает линейный порядок маркеров в хромосоме. По своей разрешающей способности они занимают промежуточное положение между генетическими картами и собственно физическими картами (ряд авторов относит цитогенетическое картирование к методам физического картирования геномов). Цитогенетические карты основываются на расположении генов без определения их вариабельности, тогда как возможность построения генетических карт зависит от наличия аллельного полиморфизма локусов. Построение цитогенетической карты облегчает развитие других типов физических карт, а именно, дает "скелет", на котором помещаются маркеры или контиги перекрывающихся клонов.
Для построения цитогенетических карт млекопитающих в настоящее время используется ряд методов. Определение хромосомной, а в большинстве случаев и субхромосомной локализации маркеров проводят с использованием гибридов соматических клеток между различными видами млекопитающих или непосредственной гибридизации in situ уникальных молекулярных зондов на митотические хромосомы. К основным методам формирования цитогенетических карт относятся также - хромосомный сортинг (проточная цитометрия), микродиссекции и микроклонирование определенных геномных фрагментов и сравнительное генетическое картирование (сравнительная цитогенетика).
В 90-е годы метод гибридизации получил развитие в модификациях: FISH (гибридизация с использованием флюоресцентной метки) и PRINS (метод, сочетающий гибридизацию на метафазных хромосомах специфических праймеров с последующей ПЦР, включающей меченый биотином нуклеотид в продукт амплификации). Этот подход стал основным методом для построения цитогенетических карт.
Разрешение этого метода составляет от 1 до 3 млн.п.н., поэтому гибридизация является методом картирования с низким уровнем разрешения.
Среди цитогенетических методов большое распространение получил метод картирования геномов млекопитающих с помощью гибридов соматических клеток, с которым связан первый прорыв на пути построения карт генома человека и успехи клеточной биологии. В 70-ым годам была разработана техника экспериментального конструирования способных к размножению межвидовых клеточных гибридов. Гибридные клоны получают путем искусственного слияния культивируемых соматических клеток разных видов, в частности клеток человека и различных грызунов: китайского хомячка, мыши, крысы. Гибридные клетки, значительно превосходящие по своим размерам исходные родительские клетки, оказываются способны не только переживать в условиях культивирования, но и размножаться. Однако размножение этих тетраплоидных гибридов, как оказалось, сопровождается утратой хромосом, причем в первую очередь элиминируются хромосомы человека.
Так были получены панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение белков человека, специфических мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах позволяет определить хромосомную принадлежность соответствующих генов. Техника соматической гибридизации явилась одним из наиболее мощных инструментов для нахождения связей между группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и даже их отдельными сегментами. Таким способом удалось локализовать сотни аутосомных генов.
Соматические гибриды спонтанного происхождения были получены в 1960 году, с тех пор развитие работ по гибридам соматических клеток шло по следующим направлениям: 1) поиск безопасных, удобных и эффективных агентов для слияния клеток; 2) создание селективных систем, позволяющих выделять гибриды соматических клеток; 3) изучение феномена сегрегации хромосом, направления и степени, а также возможности направленной сегрегации в соматических гибридах; 4) использование гибридов соматических клеток для создания хромосомных карт млекопитающих.
Для тонкого картирования разработаны два метода: перенос генов, опосредованный хромосомой (CMGT) и перенос генов в процессе слияния облученной клетки-донора с необлученным реципиентом (IFGT, от англ. irradiation and fusion gene transfer). Первый способ предполагает инкубацию очищенных митотических хромосом с клетками реципиента в присутствии фосфата кальция. При этом происходит встраивание фрагментов донорных хромосом в хромосомы клетки-реципиента. Для идентификации гибридов, содержащих нужные фрагменты ДНК донора, применяют соответствующие методы селекции.
Наиболее широко распространенный пример такого подхода - НАТ-селекция (от англ. hypoxanthine, aminopterin, thymidine) . В присутствии аминоптерина (или сходного с ним метатрексата) ингибируется синтез новых предшественников ДНК. Клетки, лишенные фермента тимидинкиназы (ТК), не могут утилизировать экзогенный тимидин и гибнут в присутствии аминоптерина. Аналогично, клетки, лишенные гипоксантин- фосфорибозилтрансферазы (HPRT), не могут усваивать гипоксантин и также, нежизнеспособны в присутствии аминоптерина.
К сожалению, встроенные фрагменты хромосом зачастую претерпевают реорганизацию, кроме того, есть достоверные данные о предпочтительном проникновении в клетку последовательностей из центромерных областей. Эти недостатки не позволяют использовать CMGT для тотального картирования, хотя данный метод весьма эффективен для обогащения специфическими фрагментами хромосом - составной части стратегии клонирования, называемой "обратной генетикой".
1.3. Физическое картирование.
В отличие от генетических карт, построенных на основе групп сцепления и дающих статистические расстояния между ДНК-маркерами и генами, физическое картирование позволяет определять физические расстояния между маркерами в каждой хромосоме.К методам физического картирования относят рестрикционное картирование, RH-картирование, клонирование в YAC (от англ. yeast artificial chromosome), BAC (от англ. bacterial artificial chromosome), космидах, плазмидах и других векторах и контиг-картирование на их основе, а также секвенирование ДНК.
Рис.4 Генетическая карта норки содержит 85 генов, 82 из которых картированы в лаборатории; для 18 генов установлена их региональная локализация, для 8 показан их порядок, а 7 генов были отнесены к группам сцепления хромосом 7 и 12. Рядом с идиограммами хромосом норки приведены данные по ZOO-FISH. Видно, что в геноме норки существуют крупные районы хромосом, гомeологичные хромосомным районам человека
Использование искусственных хромосом создает основу для проведения физического картирования как на хромосомном, так и на субхромосомном уровне.
Основой физического картирования генома является построение физических карт, т.е. определение порядка расположения физических маркеров вдоль молекулы ДНК. В качестве физических маркеров могут выступать сами гены, анонимные фрагменты ДНК (D-сегменты), точки расщепления ДНК рестриктазами и т. п.
Однако при развитии работ по физическому картированию геномов млекопитающих исследователи столкнулись с трудностями при совмещении данных по картированию. Для преодоления этой проблемы в 1989 г. было предложено стандартизовать все обозначения меченных последовательностей ДНК в геноме, включая все типы картированных последовательностей, будь то просто картированный сегмент ДНК с неизвестной функцией (D-сегменты), последовательность с необычными сайтами рестрикции, проба, выявляющая полиморфизм, последовательность, гибридизующаяся с определенным "бэндом" при гибридизации или STS-маркеры (от англ. "sequenсed tagged site").
Основной особенностью STS-маркеров, а также и основным требованием к ним, является их уникальность в геноме. Эти маркеры облегчают перевод различной информации по картированию на единый "язык" STS для анализа и хранения генетической и молекулярной информации, кроме того, оптимизируется процесс насыщения физической карты генома человека маркерами. Созданные на сегодняшний день электронные молекулярно-генетические базы данных значительно облегчают поиск информации по картированию и секвенированию последовательностей любого изучаемого вида, позволяют оценивать степень гомологии и эволюционной связи между геномами различных видов. В настоящее время одно из основных направлений в данной области - это перевод всех STS-маркеров на основу ПЦР для более удобного использования. К исходному секвенированному участку ДНК подбирается пара праймеров, как правило, с учетом того, чтобы расстояние между ними не превышало 1 т.п.н. для удобства проведения ПЦР. Если участок и праймеры к нему не имеют аналогов в базе данных, содержащих секвенированные на данный момент последовательности ДНК, то праймеры синтезируют и с ними проводят ПЦР, где в качестве матрицы используют тотальную ДНК генома. Если полученный амплификат представляет собой единственный фрагмент на геном, то эта последовательность может считаться уникальной и может быть использована как STS. Вся информация, касающаяся каждого маркера, хранится в базах данных (NCBI, EMBL, DDBJ, GDB и др.). Она включает в себя сведения о нуклеотидной последовательности праймеров, условия реакции ПЦР, длину продукта амплификации и его нуклеотидную последовательность. Одним из результатов международной программы "Геном человека" явилось создание такого количества STS-маркеров, которое позволило покрыть ими весь геном человека через каждые 50 т.п.н. вдоль каждой хромосомы (на сегодняшний день в базах данных зарегистрировано более 60000 STS-маркеров).
Совмещение карт возможно благодаря локализации многих клонированных генетических маркеров на физических картах с помощью гибридизации, то есть привязке к определенным хромосомным сегментам. Эти локусы служат для взаимосвязи генетических карт с физическими и дают возможность выяснения соотношения между генетическими расстояниями в сантиморганах и физическими расстояниями, выраженными в тысячах пар нуклеотидов.
Рис.6 Результаты экспериментов по тестированию плюрипотентности внутривидовых гибридных клеток от слияния эмбриональных стволовых (ЭС) клеток (линия HM-1 получена от мыши линии 129/Ola, справа) со спленоцитами взрослой самки мыши (линия DD слева). При введении гибридных клеток в полость бластоцисты (реципиентная линия C57BL/J, слева) получено 5 химерных мышей, одна из которых представлена на рисунке в центре. Пятна желтой окраски появились в результате размножения гибридных клеток и их участия в формировании волосяного покрова химеры. Результаты биохимического анализа (маркер Gpi-1, кодирующий глюкозо-6-фосфат изомеразу) химер показали, что гибридные клетки внесли вклад в формирование большинства органов и тканей
4) Генетическое картирование генома крупного рогатого скота (КРС)
Отечественным ученым принадлежит приоритет в картировании генов сельскохозяйственных животных: в 1926 г. А. С. Серебровский и Е. Т. Васина-Попова описали расположение генов в половой хромосоме курицы. Успешно проводившиеся А. С. Серебровским исследования по генетическому картированию были прерваны и до сих пор в нашей стране на материале сельскохозяйственных животных не возобновлены. В то же время за рубежом интерес к построению генетических карт лабораторных и домашних животных все более возрастает. Иллюстрацией сказанного может служить то, что на исследования генома собаки с целью построения генетической карты этого вида в США ассигновано на 5 лет 750тыс. долларов. Целью этого проекта является нанесение на генетическую карту до 400 маркеров, что позволит в частности, определить локализацию генов тех или иных наследственных болезней.
Естественно, что особое внимание уделяется картированию геномов важнейших видов сельскохозяйственных животных. Созданный в 1990 г. проект их генетическое картирование должен был получить в 1991 г. финансирование в размере 10 мил. долларов в год. Первый объект планируемых исследований – крупный рогатый скот, в дальнейшем предполагается изучить геном овец, коз, свиней, лошадей, кур. В настоящем обзоре мы рассмотрим современное состояние исследований, посвященных построению генетических карт генома крупного рогатого скота (КРС) – биологического вида Bos taurus.
При картировании генов крупного рогатого скота исследуются три метода. Первый из них – популяционно- генеалогический анализ. Именно с помощью этого метода был обнаружен первый случай сцепления генов у крупного рогатого скота (тесное сцепление генов казеинов молока). КРС относится к числу малоплодных и медленно размножающихся животных, поэтому стандартный генетический анализ в этой же ферме, в которой он используется для картирования геномов лабораторных животных, в данном случае невозможен. Применяемый подход заимствован из арсенала генетики человека и состоит и состоит в определении достоверности отклонения наблюдаемой частоты рекомбинации между двумя генами от 0,5 т. е. определяется наличие сцепления. Соответствующий статистический тест носит название lod-score-test. При использовании этого теста для каждой семьи, в которой обнаружено расщепление по анализируемым генам вычисляется величина z:
Картирование – самый простой способ состыковать контиги.
Картирование геномов может быть генетическое и физическое.
Генетическое картирование:
Содержит ген – фенотипический маркер;
Молекулярные маркеры:
RFLP (полиморфизм длин рестрикиционных фрагментов) –это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикций (расщепляют нуклеиновые кислоты в середине) и дальнейший анализ образовавшихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза;
SSLP (полиморфизм длин простых повторов)- Их есть 2 типа: минисателлиты и микросателлиты. Микросателлиты – повтор 2,3,4 н.п. Это ошибки в работе ДНК-полимеразы. Когда есть участок, где много раз повторяется олигонуклеотид, есть вероятность проскальзывания ДНК-полимеразы. Она с определенной долей вероятности может диссоциировать с матрицей и присоединиться к соседнему повтору. В результате при репликации будет либо на один повтор больше, либо на один меньше;
SNP (Полиморфизм по одиночным нуклеотидам) – отличия последовательности ДНК размеров в 1 нуклеотид в геноме представителя одного вида;
Детекция молекулярных маркеров:
1. Гибридизация ДНК:
1.1. Зонды будут спариваться с одноцепочечной ДНК, образуются полные или неполные комплементы.
1.2. Электрофорез в ПАА. Перенос с помощью нитроцеллюлозной бумаги. Радиомеченные пробы гибридизуются с ДНК. Выявляются авторадиографически.
Используется для детекции молекулярных маркеров:
1. Повторяющихся локусов;
2. Полиморфизм рестрикционных фрагментов (ПДРФ, RFLP) – обработка рестриктазой.
Типы повторов:
1. Короткие (2-4 н.) полиморфизм длин простых последовательностей (SSLP);
2. Минисателлиты (до 25 н.) VNTR;
3. Микросателлиты (ди- или тетрануклеотиды) STR, SSR;
Полиморфизм по одиночным нуклеотидам в агарозном геле (SNP);
(AGTCAG AAATC);
(AGTCAC AAATC);
Использование ДНК-чипов методом фотолитоавтографии.
Стеклянная подложка обрабатывается, на неё наносится нуклеотид. 5’-конец блокируется, освещение лазером удаляет блокирующую группировку. Так можно нанести сотни тысяч зондов.
Негибридизующиеся фрагменты отмываются; определяется по пятнам (от флуоресцентно меченной ДНК).
Недостатки:
1. Ограниченная разрешающая способность (максимум 1 ген на 3.3 кн. у E. coli и 1 ген на 10 кн. У S. cerevisiae);
2. Ограниченная разрешающая способность из-за неравномерности кроссинговера.
Основные методы физического картирования:
1. Рестрикционное картирование;
2. FiSH (флуоресцентная гибридизация in situ);
3. Картирование STS;
Рестрикционное картирование – это определение относительного расположения и определенных сайтов рестрикции на геномной карте и определение расстояний между ними.
Особенности крупных участков:
1. Использование рестриктаз, распознающих 7-8 н.;
2. Использование рестриктаз, в сайт распознавания которых входят редкие комбинации нуклеотидов;
3. Использование специальных методик гель-электрофореза с переменным электрическим полем для разделения крупных фрагментов ДНК.
Классическим походом является электрофорез для определения размеров фрагментов. Нужно как минимум 2 рестриктазы, каждая из них обрабатывает исследуемый фрагмент ДНК.
Первое что нужно сделать это подобрать рекстриктазу которая разрезает реже, чтоб получилось разумное число фрагментов. Здесь вот статистически рассчитанная частота встречаемости сайтов для различных эндонуклеаз с разным размером сайта. Берутся рестриктазы которые имеют самый длинный сайт, плюс подбираются специально еще такие рестриктазы в сайтах которых есть редкие комбинации нуклеотидов. Таким образом мы получаем реакцию рестрикции с разумным количеством фрагментов, но нужно все равно определить размер этих фрагментов. Для того чтобы определить размер крупных фрагментов используются специальные методики: либо электрофорез в переменном поле, либо другие способы визуализации которые объединяются под названием оптическое картирование.
Первое – таким образом можно найти можно найти ферменты, которые будут еще реже резать. В частности на примере генома человека, этот сайт показывает почему у нас мало CG комбинаций. В геноме человека CG буквы расположены рядом встречаются только в промоторных областях. Соответственно в большей части генома они не присутствуют. Почему так происходит? Потому что цитозин метилируется, т.е. происходит присоединение метильной группы. Был цитозин, получился 5-метилцитозин. Любая аминогруппа в составе азотистых оснований с достаточно высокой вероятностью способна гидролизоваться. Остаток от гидролиза – замена аминогруппы на оксогруппу, а если происходит замена цитозина, то мы получаем урацил который является четным основанием и соответственно системой репарации вырезается, но если это 5-метилцитозин, то мы получаем тимин, а это легальное основание в составе ДНК. Соответственно если вот буква С не критична в соответствующем месте геномной последовательности, то эволюционное давление достаточно жесткое - замена буквы С на букву Т. Эволюционное давление будет больше в кодирующей последовательности и в промоторной последовательности, потому что метилированные CG последовательности являются важным регуляторным сигналом который контролирует. Это так называемые CPGS-права там где они есть почти наверняка будет регуляторная область, которая активирована. Таким образом если задача – подобрать редкощепящие рестриктазы, то потребуется подобрать такие рестриктазы в сайт которых входят эти комбинации нуклеотиды. Давайте посмотрим что получается.
Один из вариантов это электрофорез в пульсирующем поле. Стандартный электрофорез очень плохо подходит для фрагментов с более 50 тыс. н.п. Они все собираются в кучку наверху геля, не разделяются, некоторые из них вообще остаются в лунке. Чтобы их разделить меняются условия электрофореза – два электрода меняются на 4 и напряжение подается переменное то на один электрод, то на другой. Когда подается напряжение на первый электрод фрагмент ДНК движется очень короткое расстояние, застревает в порах агарозы. Напряжение меняется, ток подается на другие электроды, фрагмент ДНК выдергивается из тех ячеек в которых он застрял и чуть-чуть двигается, потом направление опять меняется. Движение получается зигзагообразное. Но шажки очень короткие и суммируются в линейное движение. Фактически получается обычный электрофорез, разница в том что крупные фрагменты будут четко разделены, т.к. подвижность совсем другая. Не так жестко привязана к массе фрагментов. У электрофореза есть один большой недостаток – это не прямое измерение размеров ДНК. По одной из дорожек будет бежать молекулярный маркер и идет сопоставление длины пробега – косвенный показатель.
То, что называется оптическим картированием – это замена электрофорезу, здесь размер фрагментов измеряется непосредственно. Суть его заключается в том, что ДНК одним из нескольких способов распрямляется, из скрученного клубка она вытягивается. Причем вытягивается под напряжением. Причем напряжение молекулы ДНК, обрабатываются рестриктазой, после разрезания концы молекулы разъезжаются в стороны от места разреза это все можно увидеть под микроскопом. Потом такой препарат микроскопируется, ДНК окрашивается интеркалирующим флуоресцентным красителем и места разрыва видны. Прямое измерение длины под микроскопом. Два варианта получения линейные напряженные ДНК: в обоих случаях используется свойство границы между различными фазами. Когда ДНК проходит через фазовый раздел вытягивается. Первая из методик использует ДНК в растворе расплавленной агарозы. ДНК наносится на предметное стекло, через некоторое время агароза начинает застывать. Застывание никогда не идет равномерно, оно всегда начинается в каком-то месте. Фронт кристаллизации агарозы движется с начальной точки и распространяется. Когда он проходит через молекулу ДНК он тянет эту молекулу за собой и в результате мы получаем выровненную молекулу в напряженном состоянии. Потом сюда добавляется фермент, в некоторых случаях фермент сразу иммобилизован на стекле, а потом добавляются ионы магния вместе с соответствующим буфером, а может быть наоборот – потом фермент. Но лучше первый вариант – лучше диффундирует. Другой метод основан на том что покровное стеклышко очень медленно достается из раствора ДНК. Оно обрабатывается раствором силаном который увеличивает сорбцию ДНК, молекулы какой-то частью сорбируются на этом стеклышке и оно очень медленно, по паре миллиметров в час вытаскивается из раствора и когда оно проходит через пленку поверхностного натяжения молекулы ДНК вытягиваются от того места где они зафиксированы вниз. Направление противоположное движению стеклышка. Мы получаем выровненную молекулу в напряженном состоянии, потом стеклышко обрабатывается рестриктазой.
При неспаренном состоянии гибридизации нет. Детекция SNP методом гибридизации в растворе. При гибридизации шпилька раскрывается.
Следующая методика картирования флуоресцентная гибридизация на препаратах – FISH.
Здесь непосредственно визуализуется какой-нибудь локус, в соответствии с позицией флуоресцентного зонда на окрашенных цитологическим красителем препарата хромосом (скрученные хромосомы). Препарат наносится на стекло, фиксируется на нем и подвергается частичной денатурации. В результате мы получаем по длине хромосомы участки в одноцепочечном состоянии. Затее добавляется проба которая гибридизуется с этими участками, и затем такой аппарат окрашивается соответствующими красителями и микроскопируется. Микроскопия ведется в видимом диапазоне, микроскопия флуоресцентная. Проба облучается лазером в определенной длине волны и наблюдается флуоресценция. В результате мы поучаем картину флуоресценции наложенную на характерную для данной хромосомы картину полос. Мы сделали зонд под конкретный ген и сразу видим где на хромосоме этот ген расположен.
Недостатки: разрешающая способность достаточно невысокая, не более 1 млн.н. п. между соседними зонами. Чтобы повысить разрешение используются модификации методик.
Самая простая фактически ничего не меняет – механическое растяжение хромосом. Препарат хромосом крутится в центрифуге на небольших оборотах. Хромосомы вытягиваются под действием центробежных сил, главное не переборщить с оборотами. Белки не соединяются остаются в тех позициях в которых они зафиксированы и можно окрасить. Разрешение в 4-5 увеличивается. До 200 тыс.н.п. между соседними маркерами. Если нужно более высокое разрешение используются другие модификации – не метафазные хромосомы (разрешение до 20-25 тыс.н.п.) и fiber-FISH, те же самые хромосомы, только которые дополнительно растянуты – растягивание в геле, молекулярное «причесывание», разрешение до 10 тыс. н. п. Недостаток этих двух методик – мы не можем привязать флуоресцентный зонд к цитологической карте. Мы можем только расположить 2 зонда друг относительно друга и определить расстояние между зондами. Должен быть зонд позиция которого известна, и мы должны одновременно видеть и этот зонд и тот зонд который нас интересует.
Еще один способ картирования это STS-картирование. Оно чем-то похоже на генетическое картирование, но использует не рекомбинацию, а другой способ определения относительного расстояния. Критерием здесь служит частота фрагментации ДНК при построении геномных библиотек и фрагментов. Фактически суть та же самая: разрыв молекулы ДНК происходит под действием низкого ультразвука или под действием рестриктаз. отличие также в том, что служит маркерами. STS-маркеры – это известные фрагменты ДНК, которые встречаются в геноме один раз и последовательность должна быть известна.
Когда такая последовательность известна можно подобрать пару праймеров в пределе этих 100-500 н. п. и получить ПЦР фрагмент, по которому обычно такой маркер и детектируется. Самый простой способ отбора последовательностей для получения этих маркеров – это использовать EST сиквенсы это коротенькие кусочки кДНК, сделанные на матричной РНК. Поскольку это копия мРНК это она гарантированно встречается один раз в геноме, поскольку большинство генов является уникальными. Соответственно это изначально уникальная последовательность. Другие маркеры, менее удобные, маркеры полиморфные по простым последовательностям – минисателлиты или микросателлиты. Можно использовать и случайные геномные последовательности, но с ними сложнее т.к. нужно четко доказывать что они уникальные геномные последовательности. Для того, чтобы определить позицию таких маркеров нужен другой компонент – реагент картирования. Это просто набор фрагментов ДНК той или иной библиотеки. Чем маркеры ближе друг к другу на реальной карте хромосомы, тем выше вероятность, что они окажутся в одном и том же фрагменте ДНК.
Тесно сцепленные маркеры, рядом расположены соответственно они попадают в большое число фрагментов. Маркеры расположенные дальше, чаще всего попадают на разные фрагменты ДНК, Если маркеры окажутся еще дальше – расстояние между ними будет превышать размер фрагментов библиотеки, они вообще не будут детектироваться совместно. Все это статистически общипывается – можно по частоте совместного нахождения этих маркеров в библиотеке достаточно точно определить расстояние между ними на реальной карте хромосом. При условии что фрагментация лишь случайна. Источники фрагментов: стандартная клонотека, набор клеток-радиационных гибридов.
Клетки-радиационные гибриды наиболее удобны при STS-картировании. Это старая технология, фактически вариант клонирования эукариотической ДНК in vivo. Речь идет о гибридизации облученных клеток с необлученными клетками. Причем необлученные клетки, как правило, клетки китайского хомячка, а облученные – клетки любого млекопитающего в т.ч. человека. Если допустить, что это человеческие клетки, они подвергаются воздействию очень высоких доз γ-радиации и такая клетка становится нежизнеспособной, мы получаем клетку с серьезно фрагментированной ДНК и репарировать такие хромосомы невозможно. Если такую клетку слить с клеткой другого млекопитающего, то система репарации неповрежденной клетки будет пытаться репарировать эти двунитевые разрывы и результатом будет случайные включения фрагментов вот этой ДНК в различные участки своих неповрежденных хромосом. То что не удалось включить при делении клетки будет элиминировано, а то что включилось будет стандартно наследоваться в этой клеточной линии. Поскольку в каждую хромосому включается несколько фрагментов чужеродной ДНК при правильной дозе радиации достаточно около 100 клеток ста линий таких гибридом для того, чтобы построить подробную STS-карту эукариотического генома.
При помощи ПЦР зафиксируется наличие маркеров в одном образце ДНК и высчитывается частота нахождения этих маркеров во всех вариантах линий. Есть различные механизмы автоматизации.
Суть его сводится к тому, что для детекции используется не электрофорез, а флуоресцентная метка, причем эта метка достаточно хитро сюда включается. Флуоресцентные нуклеотиды добавляются в реакцию, но система детекции способна улавливать только поляризованный сигнал, изначально сигнал не поляризован – детекция не идет. Ситуация включается при включении такого нуклеотида в состав ДНК. Эти нуклеотиды являются терминирующими поэтому они включаются только один раз и после включения флуоресцируют немного по-другому. Делается ПЦР, если продукт присутствует добавляется еще один внутренний праймер; он гибридизуется с одной из цепочек продукта и к нему присоединяется этот нуклеотид. После этого сигнал оказывается поляризованным и его можно детектировать. Если продукта нет – сигнала не будет. С такой модификацией ПЦР детекции можно в масштабах эукариотического генома достаточно быстро построить физическую карту генома.
Когда мы начали разговаривать про sts-картирование, я говорил, что второй вариант источника фрагментов для картирования только стандартная клонотека. Она, немножко менее удобна в том плане, что гораздо больше клонов приходится использовать, ниже получается частота совместного нахождения на одном фрагменте, но скрининг получается более протяженный. Но, есть преимущества, которые по крайней мере частично компенсируют этот недостаток, они заключается в том, что одни и те же клоны можно использовать и для построения карты и те же самые клоны можно затем брать для секвенирования. Одну и ту же клонотеку можно использовать для картирования, а потом для определения нуклеотидной последовательности, поэтому тут не надо специально что-то конструировать, а уже имеющуюся клонотеку можно использовать для такого картирования.
Ну вам может быть рассказывали когда была цитология, про принцип fluorescence assisted cell sorting, то есть окрашивание этих клеток идет флуоресцентным красителем, то есть очень небольшая модификация этой методики позволяет открывать не клетки, а хромосомы. И этот принцип соответственно позволяет разделить весь хромосомный набор на отдельные хромосомы и затем, библиотеки делаются из ДНК одной хромосомы. Это колоссальная помощь потому что, одно дело работать в масштабе генома размером 3 млрд нуклеотидных пар, другое дело в масштабе одной хромосомы, тогда у нас получится в среднем 150 млн. Вы чувствуете, как падают масштабы и естественно этот метод используется. Я надеюсь, что вы это хорошо помните, здесь все предельно просто. То, что нужно сортировать, окрашивается флуоресцентным красителем, в данном случае хромосомы. Количество красителя, который связывается с хромосомой зависит от нескольких факторов, в первую очередь от размера хромосомы – это основной фактор, ну и во вторую очередь – это структура белков, которые связаны с этой хромосомой. Белки немножко различаются, в первую очередь различаются количеством гетерохроматина, ну это определяет то, что нет прямой корреляции между размером хромосомы и интенсивностью окрашивания. Ну, что происходит потом, потом раствор капается из пробирки маленькими каплями, каждая концентрация подобрана таким образом, чтобы капля была либо пустой, либо содержала одну хромосому, ни в коем случае не две. Затем капля сбоку освещается лучом лазера, и если в капле присутствует хромосома, то возбуждается флуоресценция, флуоресценция детектируется детектором. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству красителя, который связался. Это количество характеризует каждую хромосому уникальным образом, вот на этой стадии можно сказать, какая хромосома в этой капле находится. Затем вот эта пара электродов в соответствии с интенсивностью флуоресценции заряжает каплю так, что получается достаточно мощное электрическое поле. Чем больше флуоресценция, тем больше заряд капле сообщается. Капля летит дальше, пройдя через следующую пару электродов. Эти электроды отклоняют каплю вправо или влево в соответствии с зарядом. Чем больше заряд, тем больше будет отклонение в одну сторону, в одну сторону она в общем будет отклоняться и соответственно каждая хромосома будет капать в свою пробирку. Правильный подбор красителя в случае хромосом человека позволяет таким образом раскапать все кроме одной пары хромосом по отдельным пробиркам. Для оставшейся пары хромосом берут другой краситель, который немного по другому связывается и эту пару тоже можно разделить. Таким образом, мы получаем из тотального препарата ДНК препараты отдельных хромосом, что существенно упрощает дальнейшую работу. На этом мы с картированием и библиотеками заканчиваем.
Генетическое картирование до сих пор используется и будет использоваться т.к. помимо составления карт генома у него есть важное применение – есть методика маркерсистированной селекции которая позволяет очень быстро вводить нужный ген.
Генотип такого нового сорт из дикого четко контролирует присутствие этого гена по молекулярному маркеру. Недостаток заключается в ограниченной точности. для E.coli и дрожжей генетическое картирование шло с 50х гг и была картирована тысяча генов. В случае E.coli и дрожжей максимальная плотность таких карт один ген на 3тыс.н.п. у E.coli и один ген на10 тыс.н.п. у дрожжей. И в том и в другом случае получается что удается картировать только каждый третий, каждый четвертый ген . Большей точности достигнуть не получается. Вторая проблема связана с тем что кроссинговер идет неравномерно по длине хромосомы , есть горячие точки кроссинговера, есть участки хромосомы которые блокируют кроссинговер – это вносит дополнительную ошибку и кроме того может поменять позиции некоторых локусов на генетической карте. Также из-за неаккуратности увеличивается число экспериментальных ошибок.
У картирования 2 задачи – определить относительное расположение каких-то участков на хромосоме , а вторая задача – определить расстояние между ними . Т.е. на счет относительного расположения ген картирование более или менее справляется с этим, если посмотреть на слайд позиции этих маркеров совпадают, кроме двух они переставлены местами, очевидно здесь присутствует какая-то аномалия. Что касается расстояния между маркерами, то здесь уже все несколько хуже – вы видите что некоторые расстояния оказываются несколько больше, некоторые несколько меньше чем реальные расстояния. Соответственно сейчас все больше и больше значения приобретают методики физического картирования, которые сейчас являются неотъемлемой частью геномного проекта как при классическом подходе к секвенированию, так и при шотган подходе, потому что в большинстве случаев для ликвидации пробелов на стадии финиширования все равно без карты не обойтись, особенно для эукариотических геномов.
Независимо от того, наследуется ли болезнь по одному из менделирующих типов или просто чаще встречается у родственников больных, генетический вклад в болезнь состоит из генотипических различий среди членов семьи или вызывающих болезнь, или изменяющих в ту или другую сторону восприимчивость к болезни.
Геномика , завершив исследование последовательности ДНК человека в ходе реализации проекта « », обеспечила генетиков полным списком всех генов человека, знаниями об их положении и структуре и каталогом нескольких миллионов вариантов последовательностей ДНК, обнаруженных в разных популяциях. Некоторые из этих вариантов весьма частые, другие редкие, остальные различаются по частоте в разных этнических группах.
Некоторые варианты имеют явные функциональные последствия , другие - несомненно, нейтральны. Для большинства значение для человеческого здоровья неизвестно.
Мы также очертили роль отбора и дрейфа генов , влияющих на частоту различных аллелей в популяции. В статьях на нашем сайте МедУнивер мы обсудим, как процесс мейоза, действуя во времени и в пространстве, определяет связь между генами и полиморфными локусами с их окружением.
Сначала мы представим, какую информацию о «генетическом пейзаже » генома человека дали исследования наследования генетических вариантов, а затем опишем два фундаментальных метода идентификации генов болезни. Первый метод, анализ сцепления, основан на обследовании семей.
Анализ сцепления имеет явные преимущества перед семейными родословными для определения наследования болезни в нескольких поколениях, позволяя обнаружить последовательную постоянную передачу конкретного региона генома всякий раз, когда болезнь передается в семье. Второй метод, анализ ассоциаций, основан на обследовании популяций. Анализ ассоциаций прямо не зависит от родословных, но исследует повышение или снижение частоты конкретного аллеля ил» набора аллелей в выборке больных, взятой из популяции, по сравнению с контрольной группой здоровых людей.
Анализ ассоциаций имеет преимущество перед анализом всей популяции для поиска аллелей, более или менее часто обнаруживаемых у больных по сравнению со здоровой контрольной группой.
Исследования сцепления и ассоциации для идентификации генов болезней оказало огромное влияние на понимание патогенеза и патофизиологии многих болезней. Эти знания также позволили предложить новые методы профилактики, лечения и контроля.
Как картирование генов помогает медицинской генетике?
Картирование генов болезней имеет непосредственное клиническое применение, обеспечивая информацию о позиции гена, используемую для разработки методов косвенного анализа сцепления в пренатальной и пресимптоматической диагностике и выявлении носительства.
Картирование генов болезни критически важно для начального поиска гена болезни. Картирование фокусирует внимание на ограниченном регионе генома для выполнения систематизации всех имеющихся в нем генов, так что мы можем найти мутации или варианты, которые содействуют болезни (позиционное клонирование).
Позиционное клонирование гена болезни обеспечивает возможность охарактеризовать заболевание по степени локусной гетерогенности, спектру аллельной гетерогенности, частоте различных патогенных или предрасполагающих к болезни вариантов в различных популяциях, пенетрантности и ожидаемой частоте мутаций, доле общего генетического вклада в болезнь, соотнесенных с вариантами в разных локусах и природе болезни у бессимптомных пациентов группы риска.
Описание генов и мутаций
улучшает понимание патогенеза заболеваний и способствует развитию таких направлений, как:
- чувствительная специфическая диагностика прямым обнаружением мутации;
- популяционный скрининг на носительство для выявления групп риска по болезни у обследуемых или их потомства;
- клеточные и животные модели;
- лекарственная терапия для профилактики и лечения болезни или замедления ее протекания;
- лечение заменой гена.
Алфред Стёртевант (сотрудник Моргана) предположил, что частота кроссинговера на участке между генами, локализованными в одной хромосоме, может служить мерой расстояния между генами. Иными словами, частота кроссинговера, выражаемая отношением числа кроссоверных особей к общему числу особей, прямо пропорциональная расстоянию между генами. Тогда можно использовать частоту кроссинговера для того, чтобы определять взаимное расположение генов и расстояние между генами.
Генетическое картирование – это определение положения какого-либо гена по отношению к двум (как минимум) другим генам. Постоянство процента кроссинговера между определенными генами позволяет локализовать их. Единицей расстояния между генами служит 1 % кроссинговера; в честь Моргана эта единица называется морганида (М), или сантиморганида (сМ).
На первом этапе картирования необходимо определить принадлежность гена к группе сцепления. Чем больше генов известно у данного вида, тем точнее результаты картирования. Все гены разбивают на группы сцепления.
Число групп сцепления соответствует гаплоидному набору хромосом. Например, у D. melanogaster 4 группы сцепления, у кукурузы – 10, у мыши – 20, у человека – 23 группы сцепления. При наличии половых хромосом они указываются дополнительно (например, у человека 23 группы сцепления плюс Y-хромосома).
Как правило, число генов в группах сцепления зависит от линейных размеров соответствующих хромосом. Так, у плодовой мушки имеется одна (IV) точечная (при анализе в световом микроскопе) хромосома. Соответственно число генов в ней во много раз меньше, чем в остальных, значительно превосходящих ее по длине. Следует также отметить, что в гетерохроматических районах хромосом генов нет или почти нет, поэтому протяженные области конститутивного гетерохроматина могут несколько изменить пропорциональность числа генов и длины хромосомы.
На основании генетического картирования составляются генетические карты. На генетических картах крайнему гену (т.е. наиболее удаленному от центромеры) соответствует нулевая (исходная) точка. Удаленность какого-либо гена от нулевой точки обозначается в морганидах.
Если хромосомы достаточно длинные, то удаление гена от нулевой точки может превышать 50 М – тогда возникает противоречие между отмеченными на карте расстояниями, превышающими 50%, и постулированным выше положением, согласно которому 50 % кроссоверов, полученных в эксперименте, фактически должны означать отсутствие сцепления, т. e. локализацию генов в разных хромосомах. Это противоречие объясняется тем, что при составлении генетических карт суммируются расстояния между двумя наиболее близкими генами, что превышает экспериментально наблюдаемый процент кроссинговера.
После краткого рассмотрения основных методов, наиболее часто используемых в молекулярной генетике для исследования структуры и механизмов функционирования генов, представляется целесообразным на примере генома человека подробнее познакомиться с практическим применением этих методов и их модификаций для изучения больших геномов. В целях всестороннего исследования генома человека, этого колоссального по объему хранилища его генетической информации, недавно была разработана и воплощается в жизнь специальная международная программа "Геном человека" ("Human Genome Project"). Основной задачей программы является построение исчерпывающих генетических карт большого разрешения каждой из 24 хромосом человека, которое, в конечном счете, должно завершиться определением полной первичной структуры ДНК этих хромосом. В настоящее время работы по проекту идут полным ходом. В случае успешного его завершения (а это по планам должно произойти в 2003 г.) у человечества появятся перспективы досконального изучения функциональной значимости и механизмов функционирования каждого из его генов, а также генетических механизмов, управляющих биологией человека, и установления причин большинства патологических состояний его организма.
Основные подходы к картированию генома человека
Решение основной задачи программы "Геном человека" включает три основных этапа. На первом этапе необходимо специфическим образом разделить каждую индивидуальную хромосому на части меньшего размера, позволяющего их дальнейший анализ известными методами. Вторая стадия исследований предполагает определение взаимного расположения этих индивидуальных фрагментов ДНК друг относительно друга и их локализации в самих хромосомах. На завершающем этапе необходимо произвести собственно определение первичной структуры ДНК каждого из охарактеризованных фрагментов хромосом и составить полную непрерывную последовательность их нуклеотидов. Решение задачи не будет полным, если в найденных последовательностях нуклеотидов не удастся локализовать все гены организма и определить их функциональное значение. Прохождение трех вышеперечисленных этапов требуется не только для получения исчерпывающих характеристик генома человека, но и любого другого генома большого размера.
Генетические карты сцепления
Генетические карты сцепления представляют собой одномерные схемы взаимного расположения генетических маркеров на индивидуальных хромосомах. Под генетическими маркерами понимают любые наследуемые фенотипические признаки, различающиеся у отдельных особей. Фенотипические признаки, отвечающие требованиям генетических маркеров, весьма разнообразны. Они включают в себя как особенности поведения или предрасположенность к определенным заболеваниям, так и морфологические признаки целых организмов или их макромолекул, различающихся по структуре. С развитием простых и эффективных методов исследования биологических макромолекул такие признаки, известные под названием молекулярных маркеров , стали наиболее часто использоваться при построении генетических карт сцепления. Прежде чем перейти к рассмотрению методов построения таких карт и их значения для исследования генома, необходимо напомнить, что термин "сцепление " употребляется в генетике для обозначения вероятности совместной передачи двух признаков от одного из родителей потомству.
При образовании половых клеток (гамет) у животных и растений на стадии мейоза, как правило, происходит синапсис (конъюгация) гомологичных хромосом. Сестринские хроматиды гомологичных хромосом соединяются по всей длине друг с другом, и в результате кроссинговера (генетической рекомбинации между хроматидами) происходит обмен их частями. Чем дальше два генетических маркера располагаются друг от друга на хроматиде, тем больше вероятность того, что разрыв хроматиды, необходимый для кроссинговера, произойдет между ними, и два маркера в новой хромосоме, принадлежащей новой гамете, окажутся отделенными друг от друга, т.е. их сцепление нарушится. Единицей сцепления генетических маркеров является морганида (единица Моргана, М), которая содержит 100 сантиморганид (сМ). 1 сМ соответствует физическому расстоянию на генетической карте между двумя маркерами, рекомбинация между которыми происходит с частотой 1%. Выраженная в парах оснований 1 сМ соответствует 1 млн п.о. (м.п.о.) ДНК.
Генетические карты сцепления правильно отражают порядок расположения генетических маркеров на хромосомах, однако полученные при этом значения расстояний между ними не соответствуют реальным физическим расстояниям. Обычно данный факт связывают с тем, что эффективность рекомбинации между хроматидами на отдельных участках хромосом может сильно различаться. В частности, она подавлена в гетерохроматиновых участках хромосом. С другой стороны, в хромосомах часто встречаются "горячие точки" рекомбинации. Использование частот рекомбинации для построения физических генетических карт без учета этих факторов будет приводить к искажениям (соответственно занижению или завышению) реальных расстояний между генетическими маркерами. Таким образом, генетические карты сцепления являются наименее точными из всех имеющихся типов генетических карт, и их можно рассматривать только в качестве первого приближения к реальным физическим картам. Тем не менее, на практике именно они и только они позволяют локализовать сложные генетические маркеры (например ассоциированные с симптомами заболевания) на первых этапах исследования и дают возможность их дальнейшего изучения. Необходимо помнить, что в отсутствие кроссинговера все гены, находящиеся на индивидуальной хромосоме, передавались бы от родителей потомству вместе, поскольку они физически сцеплены друг с другом. Поэтому индивидуальные хромосомы образуют группы сцепления генов, и одной из первых задач построения генетических карт сцепления является отнесение исследуемого гена или последовательности нуклеотидов к конкретной группе сцепления. В табл. II.4 перечислены современные методы, которые, по данным В.А. МакКьюзика, наиболее часто использовались для построения генетических карт сцепления до конца 1990 г.